Detection of UV-induced gene activation in mammalian cells by means of a GFP vector stably integrated into the genome

Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Selbstandigkeitserklarung, Lebenslauf, Danksagung 1\. Einleitung 2\. Material und Methoden, Teil 1 2\. Material und Methoden, Teil 2 3\. Ergebnisse, Teil 1 3\. Ergebnisse, Teil 2 3\. Ergebnisse, Teil 3 4\. Diskussion 5\. Zusammenfassung 6\. Summary 7\. Abkurzungen und Glossar 8\. LiteraturUm die Vorteile der Cofaktor-unabhangigen Expression von ýGreen Fluorescent Proteiný (GFP) in heterologen Systemen und der Nachweisbarkeit von GFP in lebenden Zellen in der Untersuchung der Wirkungen ultravioletter (UV-) Strahlung auf Saugerzellen zu nutzen, sollte eine stabile Zellinie hergestellt werden, mit deren Hilfe UV-induzierte Genaktivierung in Saugerzellen anhand der grunen Fluoreszenz des Reporterproteins Enhanced GFP (EGFP) gemessen werden kann. Dazu wurden das an Saugerzellen adaptierte EGFP und seine destabilisierte Variante, d2EGFP, auf ihre Einsatzfahigkeit als Reporter fur die Promotoraktivitat in Saugerzellen untersucht. Im Vergeich zu den Ausgangszellinien zeigten stabil transfizierte, konstitutiv EGFP- oder d2EGFP- exprimierende CHO-Zellinien keine Veranderung des Wachstumsverhaltens und der Empfindlichkeit gegenuber Rontgen- und UVC-Strahlung. EGFP konnte in lebenden und Formaldehyd-fixierten Zellen durch FACS-Analyse und im Fluoreszenzmikroskop in jeder einzelnen Zelle, und zeitsparend im MTP- Fluorimeter nachgewiesen werden. Dabei besteht eine lineare Abhangigkeit der Fluoreszenzintensitat von der Anzahl der Zellen. Nach stabiler Transfektion kann das Wachtum dieser Zellen nach Behandlung mit einem zytotoxischen Agens anhand der EGFP-Fluoreszenz im MTP-Fluorimeter gemessen werden. Konstitutiv exprimiertes d2EGFP, das eine Halbwertszeit von 3 h in CHO-Zellen hat, konnte dagegen nur durch FACS-Analyse und im Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden. Zur Untersuchung der UV-induzierbaren Genexpression wurde die stabil transfizierte Zellinie HEK-pNF-kappaB/Neo hergestellt, bei der das Reportergen d2EGFP unter Kontrolle eines synthetischen Promotors steht, der vier NF- kappaB-Bindungsstellen und den minimalen Thymidinkinase-Promotor enthalt. In dieser humanen embryonalen Nierenzellinie kann UVA-induzierte Genaktivierung anhand der d2EGFP-Fluoreszenz gemessen werden. TNF-alpha loste in bis zu 90 % der Zellen dieser Zellinie d2EGFP-Expression aus und wurde deshalb als Positivkontrolle der Induktion NF-kappaB-abhangiger Genexpression verwendet. UVC- und UVB-Strahlung losten keine erhohte d2EGFP-Expression aus, Rontgenstrahlung nur in hohen Dosen. Behandlung mit dem Tumorpromotor PMA verursachte d2EGFP-Expression in bis 40 % der Zellen einer Population. Der Nachweis dieser induzierten d2EGFP-Expression erforderte die FACS-Analyse oder das Betrachten im Fluoreszenzmikroskop, eine Messung im MTP-Fluorimeter war aufgrund der geringen Fluoreszenzintensitat nicht moglich.In order to benefit from the advantages of the cofactor-independent expression of ýGreen Fluorescent Proteiný (GFP) in heterologous systems and its detection in living cells for the exploration of the effects of ultraviolet (UV) radiation in mammalian cells, a stable cell line was established, by means of which UV induced gene activation can be measured as green fluorescence of the reporter protein ýEnhanced GFPý (EGFP). For this purpose, the suitability of EGFP and its destabilized variant, d2EGFP, as reporter of promoter activity in mammalian cells was examined. By means of stably transfected, constitutively EGFP or d2EGFP expressing CHO cells, different detection methods were tested. Compared to the parental cell lines, these stably transfected cell lines showed no change in growth behaviour and in the sensitivity towards X-rays and UVC radiation. EGFP was either monitored in living and in formaldehyde fixed cells by FACS analysis and in the fluorescence microscope in each individual cell, or by a time- saving procedure using a microplate reader. A linear correlation between fluorescence intensity and cell number per well was found. Using these stably transfected cells, the effect of cytotoxic agents on cell growth can be measured as a reduced EGFP fluorescence increase in the microplate reader. Constitutively expressed d2EGFP, which shows a half-life of 3 h in CHO cells, can only be monitored by FACS analysis and in the fluorescence microscope, but not in the microplate reader. For the examination of UV induced gene expression, the stably transfected cell line HEK-pNF-kappaB/Neo was generated, in which the reporter gene d2EGFP is under the control of a synthetic promoter, which consists of four NF-kappaB binding sites and the minimal thymidin kinase promoter. In this human embryonic kidney (HEK) cell line, UVA induced gene expression can be measured as an increase of EGFP fluorescence. TNF-alpha treatment of cells gave rise to substantial d2EGFP expression in up to 90 % of the cells and was therefore used as a positive control of induction of NF-kappaB dependent gene expression. UVC and UVB radiation caused no increase in d2EGFP expression, X-rays did so only at high doses. Treatment of cells with the tumour promoter PMA produced d2EGFP expression in up to 40 % of the population. The detection of this induced d2EGFP expression required FACS analysis or inspection in the fluorescence microscope, measurement in the microplate reader was impossible due to the low fluorescence intensity

DNA DAMAGE RESPONSE OF EX-VIVO PORCINE EYE LENSES IN ORGAN-CULTURE AND IN-VITRO CULTURED LENS EPITHELIAL CELLS TO IONIZING RADIATION.

Astronauts on space missions, especially on long-term missions to Moon or Mars have a higher risk for the expression of radiation late effects such as cancer or sub-capsular cortical eye lens opacities. This is due to higher dose and different patterns of cellular energy deposition from high-linear-energy-transfer (LET) components of galactic cosmic radiation in space than that of terrestrial low-LET radiation on Earth. The eye lens is considered to be a radiation sensitive organ with radiation induced cataract to occur with a threshold absorbed dose of 0.5 Gy of sparsely ionizing radiation. For terrestrial occupational radiation lens exposure limit is set to yearly 20 mSv by the International Commission on Radiological Protection (1). Doses perceived by astronauts are much higher: in average 150 mSv per year on the International Space Station (ISS) and 1.2 to 1.4 mSv per day on Apollo and Skylab missions (2)

Kabinenluftqualität mit Schwerpunkt auf Geruchsereignissen – Eine Literaturstudie

Einleitung: Während eines Fume and Smell Events (FSE) können Dämpfe oder Gerüche ins Cockpit oder in die Flugzeugkabine gelangen. Insbesondere Kontaminationen der Zapfluft mit Triebwerks- oder Hydrauliköl werden mit vom fliegenden Personal berichteten vor allem neurologischen und/oder respiratorischen Symptomen während und / oder nach einem FSE in Verbindung gebracht. Zudem besteht Besorgnis über eine mögliche chronische Exposition mit toxischen Substanzen in der Kabinenluft. Fragestellungen: In dieser Studie wurde wissenschaftliche Literatur zu Ursachen von Gerüchen, Dampf- und Rauchentwicklung in Flugzeugen, zu chemischen Substanzen, die bei FSE in die Kabine gelangen könnten, zu einer möglichen Exposition von fliegendem Personal bei FSE, und zu akuten und chronischen Symptomen, die nach FSE-Exposition von fliegendem Personal im Kontext mit dem „aerotoxischen Syndrom“ beschrieben wurden und möglichen Ursachen, recherchiert und ausgewertet. Methodik: Durch eine orientierende Literaturrecherche wurde Suchstrings definiert und für eine systematische Recherche in den Literaturdatenbanken Medline, Web of Science und Scopus verwendet. Nach Import in eine Literaturdatenbank folgte ein Abstract- und Volltextscreening, eine Zuordnung zu den Fragestellungen und eine Bewertung der Evidenzklasse der Publikationen, die in Evidenztabellen mit einer zusammenfassenden Bewertung der Evidenzlage aufgelistet wurden. Ergebnisse: Die Häufigkeit von Kabinenluftereignissen wurde auf 1 Ereignis pro 2000-15.000 Flüge geschätzt. FSE können sich in allen Flugphasen ereignen, mit einer Häufung während Steig- und Reiseflug. Als Ursachen wurden u.a. Probleme mit der „Auxiliary Power Unit“ (APU), den Triebwerken, der Klimaversorgung/Environmental Control System (ECS), elektrischen Systemen und Küchengeräten, Kaffeemaschinen und Öfen identifiziert. Messflüge ergaben, CO, Ozon, volatile organic compounds (VOCs) und semi-volatile organic compounds (SVOCs) und Organophosphate im Normalbetrieb und bei vereinzelten Geruchsereignissen aktuelle Richt- oder Grenzwerte nicht überschreiten. Erhöhte CO₂-Konzentrationen und Partikelzählraten traten in der Taxiphase auf. Während des Reiseflugs sind die Konzentrationen von Luftkontaminanten aufgrund der hohen Luftwechselrate in der Flugzeugkabine meist gering und steigen gelegentlich durch Service und Passagieraktivitäten an. Die Beschreibung des durch FSE-ausgelösten Symptomkomplexes beruht im Wesentlichen auf Fall- und Fragebogen-Studien. Die in Expositionsstudien und nach versehentlicher Exposition beschriebenen Symptome zeigen eine gute Übereinstimmung mit einem Teil der durch Fragebogenstudien ermittelten akuten Symptome. Biomarker-Studien ergaben keinen Hinweis auf eine Organophosphatvergiftung. Genetische Variationen bei der Entgiftung wurden in einer Risikoabschätzung mit einem Faktor von 4000 als theoretischer maximaler Unterschied zwischen empfindlichen und unempfindlichen Individuen berücksichtigt. Die berichteten chronischen Symptome sind unspezifisch und divers und es bleibt unklar, ob die Symptome beim fliegenden Personal häufiger vorkommen als in der Allgemeinbevölkerung oder in anderen Berufsgruppen. Wenige Studien wiesen eine Kontrollgruppe auf und zeigten, dass Müdigkeit, Schlafstörungen und Depressionen von Flugbegleiterinnen häufiger berichtet wurden als von der Kontrollgruppe. Vereinzelte Studien mit neurologischer Untersuchung und psychometrischen Tests zeigten eine geringfügige Verschlechterung weniger Parameter. Des Weiteren wurden in kleinen Studien bei Betroffenen Veränderungen des Gehirns mit bildgebenden Verfahren gefunden, oder eine Erhöhung Nervensystem-spezifischer Auto-Antikörper im Serum. Die Bedeutung dieser morphologischen Veränderungen und der Auto-Antikörper im Krankheitsprozess und für die Diagnostik ist noch unklar. Schlussfolgerungen: Es lässt sich vermuten, dass in seltenen Fällen einer starken Kontamination der Zapfluft mit (pyrolysierten) Ölen CO, CO₂, Aldehyde und Feinstaub und ggf. weitere Substanzen ansteigen und akute Symptome wie Augen-, Nasen- und Rachenreizung, Schmerzen / Engegefühl in der Brust, Schwindel, Übelkeit, Erbrechen und Kopfschmerzen direkt oder indirekt verursachen können. Die Datenlage lässt eine Kausalitätsbewertung für mögliche chronische Symptome nicht zu. Dafür wäre u.a. ein Expositionsmonitoring des fliegenden Personals nach Identifikation geeigneter Markersubstanzen im Vergleich zu einer Kontrollgruppe ohne Exposition gegenüber Kabinenluftkontaminanten erforderlich. Danksagung: Die Literaturstudie erfolgte mit freundlicher Unterstützung der BG Verkehr

Validation of biological recognition elements for signal transduction as first step in the development of whole cell biosensors

Choosing the proper combination of receptor element, cell type and measurable signal requires major consideration for developing cell-based biosensors. In order to use physiologically relevant cellular responses towards (geno)toxic conditions, information on the mechanism of action and of the expected outcome of exposure needs to be considered

Growth and biofilm formation of Penicillium chrysogenum in simulated microgravity

Penicillium sp. are one of the main fungal genera detected on board the Russian Space Station (MIR) and the International Space Station (ISS), demonstrating its ability to grow on the space stations´ walls and to maintain growth under microgravity (1-3). As a spore-forming microorganism, Penicillium sp. poses a concern for planetary protection and to human/astronaut health, as its spores, associated with respiratory diseases, can be dispersed through the air (4). Fungal growth on the ISS has shown to promote biodegradation of the spacecraft materials, compromising their integrity. Biofilms are groups of organisms adhered to each other by self-synthesized extracellular polymeric substances, and are ubiquitous in industrial and natural environments (5). It has been reported that Penicillium sp. forms biofilms, which are associated with higher tolerance/resistance to adverse conditions (6). Therefore, biofilm formed on the ISS may have deleterious effects on astronaut’s health and/or on ISS materials. To gain valuable knowledge to control biofilm during long duration spaceflight missions, the NASA-funded project “Characterization of Biofilm Formation, Growth, and Gene Expression on Different Materials and Environmental Conditions in Microgravity” is currently being prepared. Pre-flight testing include: defining and optimizing the growth medium and culturing conditions of P. chrysogenum DSM 1075; characterizing the morphological response of P. chrysogenum growth under simulated microgravity; assessing biofilm formation by P. chrysogenum under different conditions. The study of this fungal strain represents the beginning of a new line of research on board ISS. The knowledge gained can be applicable to a) the safety and maintenance of crewed spacecraft, b) planetary protection, c) mitigation of biofilm-associated illnesses on the crew, as well as on the Earth. Besides, P. chrysogenum is of major medical and historical importance, as it presents the original and present-day industrial source of the antibiotic penicillin, and as an important producer of antifungal proteins and other relevant enzymes

Recurrent stress across life may improve cognitive performance in individual rats, suggesting the induction of resilience

Depressive symptoms are often accompanied by cognitive impairments and recurrent depressive episodes are discussed as a potential risk for dementia. Especially, stressful life events are considered a potent risk factor for depression. Here, we induced recurrent stress-induced depressive episodes over the life span of rats, followed by cognitive assessment in the symptom-free period. Rats exposed to stress-induced depressive episodes learned faster than control rats. A high degree of stress-induced depressive-like behavior early in the paradigm was a predictor of improved cognitive performance, suggesting induction of resilience. Subsequently, exposure to lorazepam prior to stress-induced depressive episodes and cognitive testing in a nonaversive environment prevented the positive effect. This indicates a beneficial effect of the stress-associated situation, with the existence of individual coping abilities. Altogether, stress may in some have a beneficial effect, yet for those individuals unable to tackle these aversive events, consecutive unpleasant episodes may lead to worse cognitive performance later in life

Radiation Response of Murine Embryonic Stem Cells

To understand the mechanisms of disturbed differentiation and development by radiation, murine CGR8 embryonic stem cells (mESCs) were exposed to ionizing radiation and differentiated by forming embryoid bodies (EBs). The colony forming ability test was applied for survival and the MTT test for viability determination after X-irradiation. Cell cycle progression was determined by flow cytometry of propidium iodide-stained cells, and DNA double strand break (DSB) induction and repair by γH2AX immunofluorescence. The radiosensitivity of mESCs was slightly higher compared to the murine osteoblast cell line OCT-1. The viability 72 h after X-irradiation decreased dose-dependently and was higher in the presence of leukemia inhibitory factor (LIF). Cells exposed to 2 or 7 Gy underwent a transient G2 arrest. X-irradiation induced γH2AX foci and they disappeared within 72 h. After 72 h of X-ray exposure, RNA was isolated and analyzed using genome-wide microarrays. The gene expression analysis revealed amongst others a regulation of developmental genes (Ada, Baz1a, Calcoco2, Htra1, Nefh, S100a6 and Rassf6), downregulation of genes involved in glycolysis and pyruvate metabolism whereas upregulation of genes related to the p53 signaling pathway. X-irradiated mESCs formed EBs and differentiated toward cardiomyocytes but their beating frequencies were lower compared to EBs from unirradiated cells. These results suggest that X-irradiation of mESCs deregulate genes related to the developmental process. The most significant biological processes found to be altered by X-irradiation in mESCs were the development of cardiovascular, nervous, circulatory and renal system. These results may explain the X-irradiation induced-embryonic lethality and malformations observed in animal studies

Towards sustainable human space exploration—priorities for radiation research to quantify and mitigate radiation risks

Human spaceflight is entering a new era of sustainable human space exploration. By 2030 humans will regularly fly to the Moon’s orbit, return to the Moon’s surface and preparations for crewed Mars missions will intensify. In planning these undertakings, several challenges will need to be addressed in order to ensure the safety of astronauts during their space travels. One of the important challenges to overcome, that could be a major showstopper of the space endeavor, is the exposure to the space radiation environment. There is an urgent need for quantifying, managing and limiting the detrimental health risks and electronics damage induced by space radiation exposure. Such risks raise key priority topics for space research programs. Risk limitation involves obtaining a better understanding of space weather phenomena and the complex radiation environment in spaceflight, as well as developing and applying accurate dosimetric instruments, understanding related short- and long-term health risks, and strategies for effective countermeasures to minimize both exposure to space radiation and the remaining effects post exposure. The ESA/SciSpacE Space Radiation White Paper identifies those topics and underlines priorities for future research and development, to enable safe human and robotic exploration of space beyond Low Earth Orbit

UNRAVELING ASTROCYTE BEHAVIOUR IN THE SPACE BRAIN: RADIATION RESPONSE OF PRIMARY ASTROCYTES

Exposure to ionizing radiation as part of space radiation, is a major limiting factor for crewed space exploration. Astronauts will encounter different types of space radiation, which may cause cognitive damage causing detrimental effects on learning and attention, elevated anxiety and depression. Due to its limited regenerative potential, especially the central nervous system (CNS) is very vulnerable towards radiation-induced damage. Astrocytes, the most abundant glial cells of the CNS, have different crucial functions in the CNS, e.g. maintaining normal brain function. In this work, the response of astrocytes towards low linear energy transfer (LET) X-rays and high-LET carbon ions was compared to unravel possible specific effects of space-relevant high-LET radiation. [...